767.锁定
免疫检查点阻断(ICB)、个性化肿瘤疫苗和溶瘤病毒疗法等免疫疗法的出现是抗肿瘤治疗史上的一个里程碑。不幸的是，免疫治疗只对有限的癌症类型有效，患者很可能在短时间内产生耐药性。最近的研究表明，在大多数实体癌中，高的肿瘤突变负荷不能作为预测ICB应答的精确生物标志物。因此，需要免疫治疗结果的预测性生物标志物。然而，对于免疫治疗如何改变免疫微环境，以及它如何通过肿瘤-非肿瘤细胞相互作用发挥作用，我们知之甚少。肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)是肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)的重要组成部分，影响预后和临床特征，在肿瘤免疫治疗中发挥基础性作用。因此，对TILs进行全面、动态的监测有助于进一步探索肿瘤免疫治疗的边界。
测序技术为细胞生物学、疾病病原学和药物反应提供了新的见解。批量测序研究以整个肿瘤为靶点，分析肿瘤内细胞的平均基因表达。然而，反映TME潜在异质性和可塑性的特定功能亚群可能被忽视。肿瘤主要由肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞组成，这些细胞可分为不同的亚型。这些细胞构成了肿瘤异质性，在肿瘤进展中起主要作用。scRNA-seq的存在可以通过分析和量化单个细胞的整个转录组来探索肿瘤异质性。对于单个细胞，其遗传学和表观遗传学被揭示来预测其在癌症中的作用和对治疗的反应。此外，基于单个细胞的空间转录揭示了单个细胞在原始肿瘤中的空间位置和细胞间通讯的局部网络。
最近，许多癌症类型的免疫环境，如黑色素瘤，乳腺癌，肝癌，非小细胞肺癌，已经被scRNA-seq揭示，其中T细胞，B细胞，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，树突状细胞，它们分泌的细胞因子趋化因子构成了一个复杂的相互作用网络。令人印象深刻的是，T细胞一直是研究抗肿瘤功能的主要焦点，包括na?veT细胞、效应记忆T细胞、衰竭T细胞、调节性T(Treg)细胞和居住记忆T细胞，这些在几种癌症中都有描述。B细胞作为体液免疫的主要效应体，在TME成分和免疫治疗反应中也有显著作用。大量RNA测序显示，B细胞相关标记物在免疫治疗应答者和非应答者之间表达差异最大。B细胞以三种方式攻击癌症:1.分泌免疫球蛋白介导抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC);2.抗原提呈激活T细胞;3.分泌GranzymeB、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和IFNγ直接杀伤肿瘤细胞。因此，肿瘤浸润B细胞(TIL-Bs)可能对肿瘤预后有重要意义，并可作为预测免疫治疗的生物标志物。然而，专注于B细胞的研究比专注于T细胞的研究要少得多，这使得它们在癌症免疫治疗中的复杂机制不清楚。随着scRNA-seq技术的发展，TIL-Bs的位置和功能可以被精确地确定，这可能有助于更好地理解其机制。从单细胞的角度来看，在本文中，我们讨论TIL-Bs亚种群分化轨迹，与其他细胞的相互作用，并总结B细胞的机制调节时间和影响免疫治疗效果，旨在为肿瘤研究提供一种新的方式针对B细胞。
单细胞测序可以进一步探索肿瘤内的异质性。与流式细胞术、质谱法或其他任何以前的方法不同，单细胞测序是一种连续的方法，而不是离散的方法。scRNA-seq的步骤主要包括以下四个步骤:(1)单细胞分离，(2)反转录成cDNA，(3)PCR扩增cDNA，(4)测序库构建(图1a)。荧光激活细胞分选(FACS)可用于从组织中分离特定的细胞(图1a)。在B细胞研究方面，采用流式细胞术筛选CD45+细胞，增加B细胞的比例；也可根据B细胞标记物直接选择靶向B细胞。作为scRNA-seq技术的突破，微流控系统将单个细胞封装在独立的微液滴中，该微液滴包含一个独特的分子标识符(UMI)，用于对单细胞内的微转录材料进行条形码。根据每个细胞的UMI，即使细胞被裂解，在后续的分析中也可以找到转录信息。基于这一特点，10×GenomicsChromium平台同时测序数千个细胞。与Smart-seq2等低通量方法相比，10×GenomicsChromium平台因其成本低、效率高而被更广泛地应用于B细胞检测。
在对多种scRNA-seq方法的比较研究中，10×Genomics也比其他高通量方法如Drop-seq和Indrops[33]具有更高的灵敏度，更高的与线粒体基因匹配的reads比例，更低的噪声。利用10×Genomics和Smart-seq2平台，可以通过不同的免疫球蛋白重链特征区分CRC中B细胞的亚群，聚类结果无明显差异。但是，10×Genomics也有不足之处，它不能覆盖所有的基因，并且存在3区域偏倚，在检测基因突变或mRNA剪接位点时可能会遗漏一些重要信息。此外，这种方法对细胞质量有更高的要求，不同的组织和不同的获取样本的方法都不同。利用scRNA-seq，我们可以更精确地定义细胞的亚型，追踪它们的发育谱系，确定克隆型和表现型之间的关系，绘制不同细胞之间的相互作用和空间关系图，从而从多个维度描述TME。此外，还需要通过一系列体内和体外实验来验证结果。我们总结了使用scRNA-seq研究的最新出版物
B细胞受体(Bcellreceptor，BCR)是一种能识别并结合特异性抗原的膜免疫球蛋白，在B细胞的分化成熟过程中起着重要作用。BCR由两条重链和两条轻链组成，其中可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因序列的重组创造了B细胞的多样性。这种多基因的复杂性使得鉴别不同的受体变得困难。然而，由于每个B细胞通常表达一个单一的受体，潜在的抗原特异性受体可以通过给定的原细胞链发现。BCR的两个主要功能如下。首先，它通过诱导B细胞激活过程中肌动蛋白骨架的实质改变和各种基因的表达来激活B细胞。其次，它介导抗原的鉴定和提取，从而导致加工过的肽在主要组织相容性复合体II(MHCII)上呈现给T辅助细胞。因此，BCR测序有助于进一步了解B细胞分化的轨迹及其特异性识别抗原性的机制，特别是当与单个B细胞的完整转录组身份配对时，这为了解癌症的发展提供了线索。更重要的是，BCR测序可以追踪来自单细胞的群体，揭示克隆型和表型之间的关系。ScRNA-seq技术在BCR测序中具有天然优势，因为含有UMI的微流控系统可以保证同源VH-VL配对的保存，而这些同源VH-VL配对在B细胞批量测序中可能会丢失。BASIC是一个在单细胞分辨率上进行BCR测序的平台。作为重建配对全长BCR序列的工具，BraCeR为B细胞的克隆推断和谱系追踪提供了一个完整的管道。LIBRA-seq是一种高通量的方法，将BCRse-序列与其同源抗原特异性连接起来，可以用来绘制特定对象中数千个B细胞的抗原特异性。
研究免疫球蛋白以探讨体液免疫的复杂性
免疫球蛋白存在于肿瘤和血清中，在肿瘤中起双重作用。抗体通过其片段可结晶(Fc)支配功能，并受翻译后修饰调控。通常，免疫球蛋白是由骨髓和脾脏的浆细胞(PCs)分泌的。组织炎症区域和肿瘤内部的pc，特别是在三级淋巴结构(TLS)中，分泌肿瘤相关抗体并直接在肿瘤上诱导原位效应。在抗肿瘤功能方面，IgG是最重要的一类人免疫球蛋白，因为它能够结合巨噬细胞和自然杀伤细胞上的Fcγ受体，并促进、ADCP和CDC的作用。此外，IgG对抗原处理和呈递至关重要，因为抗原呈递细胞(APCs)上的Fcγ受体可以与IgG包被的免疫复合物结合，激活T细胞。抗体和抗体分泌细胞(APCs)的单细胞测序有助于进一步明确B细胞体液免疫的复杂网络。已经报道了一种单细胞液滴微流控测序方案，用于特异性结合靶细胞的抗体，这也适用于初级人类是一种液滴微流体系统，用于高通量单细胞筛选分泌IgG的原代细胞，一方面，通过基于荧光的液滴内单细胞生物测定检测IgG活性，另一方面，用反转录对配对的V基因进行测序。
外周血未成熟B细胞通过高内皮静脉进入B淋巴滤泡。在B细胞滤泡中，na?veB细胞(CD27)通过固有apc(包括DCs和滤泡树突状细胞(FDCs))接触抗原，之后激活BCR信号诱导抗原提取、内化和加工，将肽呈现在MHCII上。然后，B细胞迁移到与T细胞相邻的滤泡区边缘，将抗原呈递给滤泡辅助T(Tfh)细胞。因此，Tfh细胞刺激BCR，诱导na?veB细胞分化，主要包括记忆B细胞(MBCs)、短命B细胞(short-livedPCs)和生发中心(germinalcenter，GC)B细胞。这些不依赖GC的MBCs表达RGS13，可能增加GC抗性。此外，它们缺乏B细胞进入和离开GCs的CCR7和GPR183。为了分化为GCB细胞，它们首先进入GC的暗区(darkzone，DZ)，在那里它们的膜表面免疫球蛋白通过体细胞高突变(，SHM)发生变化，称为亲和成熟。接下来，它们在亮区(LZ)经历一个竞争过程，在那里许多B细胞聚集，它们的命运取决于它们与Tfh细胞的相互作用，可能有能力捕获和呈现抗原，并发生类转换重组(CSR)。这个过程也依赖于Tfh细胞分化的结果，导致B细胞的结果。低亲和性B细胞成为长寿命MBCs，高亲和性B细胞成为PCs，其他细胞凋亡或重新进入****Z进行SHM和克隆扩增。最近的研究表明，cMyc+LZB细胞亚群包括亲和力较高的PC前体或未来的DZ进入者，以及一些亲和力较低的MBC前体。值得注意的是，BCR在这个过程中起主要作用，B细胞分化的体液免疫过程中两个重要的检查点是na?veB细胞和GCB细胞上的抗原提呈，这可能会提高体液免疫应答。此外，在单细胞水平上的完整转录组字符化将特别有助于确定na?veB细胞向PC分化过程中的转录轨迹和异质性。
B细胞分布不均一
以往对B细胞的研究主要基于免疫组化或流式细胞术，限制了B细胞的清晰分类。Wouters等人回顾了69项研究，研究tilb在19种癌症中的预后意义，以探索B细胞对抗肿瘤免疫贡献的不确定性，其中B系细胞的预后意义不同。有研究发现B细胞激活髓样细胞上的FcRγ受体，促进鳞状细胞的癌变。然而，带有抗cd20抗体的B细胞耗竭促进小鼠中黑色素瘤的发生。到目前为止，B细胞在肿瘤中的功能尚不清楚。这主要是由于在不同的组织中存在不同的B细胞亚群，在分类、功能和空间上。scRNA-seq的应用提供了高分辨率，可以揭示不同组织间分布的不确定性和不均匀性，从而揭示免疫原性或免疫抑制性TME。通常，B细胞只占正常人体器官细胞组成的一小部分。例如，B细胞在正常胰腺组织中是有限的(1%)，但在胰腺癌中约占5%。在原发肺肿瘤中，B细胞也比正常肺组织增加。此外，正常肺组织中浸润的多为分泌GranzymeB的细胞毒B细胞，而在原发性肺肿瘤和淋巴结转移中，由于肿瘤抗原的克隆扩增和生成，不同bcr的GCB细胞增多。同样，与正常乳腺组织相比，原发性乳腺癌中TIL-Bs密度增加。此外，在乳腺癌中，TIL-Bs比B细胞在次级淋巴组织中表达更多的Th1效应细胞因子(IFNG和TNFA)，提示1型细胞免疫应答。在一个三阴性乳腺癌(TNBC)队列中，scRNA-seq证据显示，TME中的B细胞具有更多的SHM和CSR的MBCs特征，而PBMCs则富含更多的na?veB细胞。这可能是因为原发性肿瘤发生时，外周血中大量na?veB细胞受到高质量肿瘤新抗原的刺激，在GCs中发生SHM，从而迁移到TME或TLS。然而，通过scRNA-seq分析，与癌旁组织和癌前组织相比，人类CRC组织的增殖状态更高，分散程度更高，MHCII类基因评分更低，抗原呈递能力更低，提示CRC存在不同的免疫抑制TME。
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测序技术为细胞生物学、疾病病原学和药物反应提供了新的见解。批量测序研究以整个肿瘤为靶点，分析肿瘤内细胞的平均基因表达。然而，反映TME潜在异质性和可塑性的特定功能亚群可能被忽视。肿瘤主要由肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞组成，这些细胞可分为不同的亚型。这些细胞构成了肿瘤异质性，在肿瘤进展中起主要作用。scRNA-seq的存在可以通过分析和量化单个细胞的整个转录组来探索肿瘤异质性。对于单个细胞，其遗传学和表观遗传学被揭示来预测其在癌症中的作用和对治疗的反应。此外，基于单个细胞的空间转录揭示了单个细胞在原始肿瘤中的空间位置和细胞间通讯的局部网络。
最近，许多癌症类型的免疫环境，如黑色素瘤，乳腺癌，肝癌，非小细胞肺癌，已经被scRNA-seq揭示，其中T细胞，B细胞，骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，树突状细胞，它们分泌的细胞因子趋化因子构成了一个复杂的相互作用网络。令人印象深刻的是，T细胞一直是研究抗肿瘤功能的主要焦点，包括na?veT细胞、效应记忆T细胞、衰竭T细胞、调节性T(Treg)细胞和居住记忆T细胞，这些在几种癌症中都有描述。B细胞作为体液免疫的主要效应体，在TME成分和免疫治疗反应中也有显著作用。大量RNA测序显示，B细胞相关标记物在免疫治疗应答者和非应答者之间表达差异最大。B细胞以三种方式攻击癌症:1.分泌免疫球蛋白介导抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC);2.抗原提呈激活T细胞;3.分泌GranzymeB、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和IFNγ直接杀伤肿瘤细胞。因此，肿瘤浸润B细胞(TIL-Bs)可能对肿瘤预后有重要意义，并可作为预测免疫治疗的生物标志物。然而，专注于B细胞的研究比专注于T细胞的研究要少得多，这使得它们在癌症免疫治疗中的复杂机制不清楚。随着scRNA-seq技术的发展，TIL-Bs的位置和功能可以被精确地确定，这可能有助于更好地理解其机制。从单细胞的角度来看，在本文中，我们讨论TIL-Bs亚种群分化轨迹，与其他细胞的相互作用，并总结B细胞的机制调节时间和影响免疫治疗效果，旨在为肿瘤研究提供一种新的方式针对B细胞。
单细胞测序可以进一步探索肿瘤内的异质性。与流式细胞术、质谱法或其他任何以前的方法不同，单细胞测序是一种连续的方法，而不是离散的方法。scRNA-seq的步骤主要包括以下四个步骤:(1)单细胞分离，(2)反转录成cDNA，(3)PCR扩增cDNA，(4)测序库构建(图1a)。荧光激活细胞分选(FACS)可用于从组织中分离特定的细胞(图1a)。在B细胞研究方面，采用流式细胞术筛选CD45+细胞，增加B细胞的比例；也可根据B细胞标记物直接选择靶向B细胞。作为scRNA-seq技术的突破，微流控系统将单个细胞封装在独立的微液滴中，该微液滴包含一个独特的分子标识符(UMI)，用于对单细胞内的微转录材料进行条形码。根据每个细胞的UMI，即使细胞被裂解，在后续的分析中也可以找到转录信息。基于这一特点，10×GenomicsChromium平台同时测序数千个细胞。与Smart-seq2等低通量方法相比，10×GenomicsChromium平台因其成本低、效率高而被更广泛地应用于B细胞检测。
在对多种scRNA-seq方法的比较研究中，10×Genomics也比其他高通量方法如Drop-seq和Indrops[33]具有更高的灵敏度，更高的与线粒体基因匹配的reads比例，更低的噪声。利用10×Genomics和Smart-seq2平台，可以通过不同的免疫球蛋白重链特征区分CRC中B细胞的亚群，聚类结果无明显差异。但是，10×Genomics也有不足之处，它不能覆盖所有的基因，并且存在3区域偏倚，在检测基因突变或mRNA剪接位点时可能会遗漏一些重要信息。此外，这种方法对细胞质量有更高的要求，不同的组织和不同的获取样本的方法都不同。利用scRNA-seq，我们可以更精确地定义细胞的亚型，追踪它们的发育谱系，确定克隆型和表现型之间的关系，绘制不同细胞之间的相互作用和空间关系图，从而从多个维度描述TME。此外，还需要通过一系列体内和体外实验来验证结果。我们总结了使用scRNA-seq研究的最新出版物
B细胞受体(Bcellreceptor，BCR)是一种能识别并结合特异性抗原的膜免疫球蛋白，在B细胞的分化成熟过程中起着重要作用。BCR由两条重链和两条轻链组成，其中可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因序列的重组创造了B细胞的多样性。这种多基因的复杂性使得鉴别不同的受体变得困难。然而，由于每个B细胞通常表达一个单一的受体，潜在的抗原特异性受体可以通过给定的原细胞链发现。BCR的两个主要功能如下。首先，它通过诱导B细胞激活过程中肌动蛋白骨架的实质改变和各种基因的表达来激活B细胞。其次，它介导抗原的鉴定和提取，从而导致加工过的肽在主要组织相容性复合体II(MHCII)上呈现给T辅助细胞。因此，BCR测序有助于进一步了解B细胞分化的轨迹及其特异性识别抗原性的机制，特别是当与单个B细胞的完整转录组身份配对时，这为了解癌症的发展提供了线索。更重要的是，BCR测序可以追踪来自单细胞的群体，揭示克隆型和表型之间的关系。ScRNA-seq技术在BCR测序中具有天然优势，因为含有UMI的微流控系统可以保证同源VH-VL配对的保存，而这些同源VH-VL配对在B细胞批量测序中可能会丢失。BASIC是一个在单细胞分辨率上进行BCR测序的平台。作为重建配对全长BCR序列的工具，BraCeR为B细胞的克隆推断和谱系追踪提供了一个完整的管道。LIBRA-seq是一种高通量的方法，将BCRse-序列与其同源抗原特异性连接起来，可以用来绘制特定对象中数千个B细胞的抗原特异性。
研究免疫球蛋白以探讨体液免疫的复杂性
免疫球蛋白存在于肿瘤和血清中，在肿瘤中起双重作用。抗体通过其片段可结晶(Fc)支配功能，并受翻译后修饰调控。通常，免疫球蛋白是由骨髓和脾脏的浆细胞(PCs)分泌的。组织炎症区域和肿瘤内部的pc，特别是在三级淋巴结构(TLS)中，分泌肿瘤相关抗体并直接在肿瘤上诱导原位效应。在抗肿瘤功能方面，IgG是最重要的一类人免疫球蛋白，因为它能够结合巨噬细胞和自然杀伤细胞上的Fcγ受体，并促进、ADCP和CDC的作用。此外，IgG对抗原处理和呈递至关重要，因为抗原呈递细胞(APCs)上的Fcγ受体可以与IgG包被的免疫复合物结合，激活T细胞。抗体和抗体分泌细胞(APCs)的单细胞测序有助于进一步明确B细胞体液免疫的复杂网络。已经报道了一种单细胞液滴微流控测序方案，用于特异性结合靶细胞的抗体，这也适用于初级人类是一种液滴微流体系统，用于高通量单细胞筛选分泌IgG的原代细胞，一方面，通过基于荧光的液滴内单细胞生物测定检测IgG活性，另一方面，用反转录对配对的V基因进行测序。
外周血未成熟B细胞通过高内皮静脉进入B淋巴滤泡。在B细胞滤泡中，na?veB细胞(CD27)通过固有apc(包括DCs和滤泡树突状细胞(FDCs))接触抗原，之后激活BCR信号诱导抗原提取、内化和加工，将肽呈现在MHCII上。然后，B细胞迁移到与T细胞相邻的滤泡区边缘，将抗原呈递给滤泡辅助T(Tfh)细胞。因此，Tfh细胞刺激BCR，诱导na?veB细胞分化，主要包括记忆B细胞(MBCs)、短命B细胞(short-livedPCs)和生发中心(germinalcenter，GC)B细胞。这些不依赖GC的MBCs表达RGS13，可能增加GC抗性。此外，它们缺乏B细胞进入和离开GCs的CCR7和GPR183。为了分化为GCB细胞，它们首先进入GC的暗区(darkzone，DZ)，在那里它们的膜表面免疫球蛋白通过体细胞高突变(，SHM)发生变化，称为亲和成熟。接下来，它们在亮区(LZ)经历一个竞争过程，在那里许多B细胞聚集，它们的命运取决于它们与Tfh细胞的相互作用，可能有能力捕获和呈现抗原，并发生类转换重组(CSR)。这个过程也依赖于Tfh细胞分化的结果，导致B细胞的结果。低亲和性B细胞成为长寿命MBCs，高亲和性B细胞成为PCs，其他细胞凋亡或重新进入****Z进行SHM和克隆扩增。最近的研究表明，cMyc+LZB细胞亚群包括亲和力较高的PC前体或未来的DZ进入者，以及一些亲和力较低的MBC前体。值得注意的是，BCR在这个过程中起主要作用，B细胞分化的体液免疫过程中两个重要的检查点是na?veB细胞和GCB细胞上的抗原提呈，这可能会提高体液免疫应答。此外，在单细胞水平上的完整转录组字符化将特别有助于确定na?veB细胞向PC分化过程中的转录轨迹和异质性。
B细胞分布不均一
以往对B细胞的研究主要基于免疫组化或流式细胞术，限制了B细胞的清晰分类。Wouters等人回顾了69项研究，研究tilb在19种癌症中的预后意义，以探索B细胞对抗肿瘤免疫贡献的不确定性，其中B系细胞的预后意义不同。有研究发现B细胞激活髓样细胞上的FcRγ受体，促进鳞状细胞的癌变。然而，带有抗cd20抗体的B细胞耗竭促进小鼠中黑色素瘤的发生。到目前为止，B细胞在肿瘤中的功能尚不清楚。这主要是由于在不同的组织中存在不同的B细胞亚群，在分类、功能和空间上。scRNA-seq的应用提供了高分辨率，可以揭示不同组织间分布的不确定性和不均匀性，从而揭示免疫原性或免疫抑制性TME。通常，B细胞只占正常人体器官细胞组成的一小部分。例如，B细胞在正常胰腺组织中是有限的(1%)，但在胰腺癌中约占5%。在原发肺肿瘤中，B细胞也比正常肺组织增加。此外，正常肺组织中浸润的多为分泌GranzymeB的细胞毒B细胞，而在原发性肺肿瘤和淋巴结转移中，由于肿瘤抗原的克隆扩增和生成，不同bcr的GCB细胞增多。同样，与正常乳腺组织相比，原发性乳腺癌中TIL-Bs密度增加。此外，在乳腺癌中，TIL-Bs比B细胞在次级淋巴组织中表达更多的Th1效应细胞因子(IFNG和TNFA)，提示1型细胞免疫应答。在一个三阴性乳腺癌(TNBC)队列中，scRNA-seq证据显示，TME中的B细胞具有更多的SHM和CSR的MBCs特征，而PBMCs则富含更多的na?veB细胞。这可能是因为原发性肿瘤发生时，外周血中大量na?veB细胞受到高质量肿瘤新抗原的刺激，在GCs中发生SHM，从而迁移到TME或TLS。然而，通过scRNA-seq分析，与癌旁组织和癌前组织相比，人类CRC组织的增殖状态更高，分散程度更高，MHCII类基因评分更低，抗原呈递能力更低，提示CRC存在不同的免疫抑制TME。
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